Ekaterinburg, Ekaterinburg, Russian Federation
Yekaterinburg, Ekaterinburg, Russian Federation
Ekaterinburg, Russian Federation
Ekaterinburg, Ekaterinburg, Russian Federation
The aim of experience was to create a method for modeling chronic periodontitis in laboratory rats. It consists in using a combination of several etiological and pathogenetic factors – mechanical damage of tissues (rupture of the circular ligament of the tooth), bacterial contamination of the wound surface, disturbance of microcirculation of tissues. In an experiment to create a model of periodontitis, 40 mature male white rats of the Wistar population were used. Morphological study was performed to assess inflammatory and reparative processes in periodontal tissues. To study the systemic reactions of the body, a set of laboratory tests was used: general clinical analysis of blood, counting the cellular composition of the spleen in smears – prints, immunological analysis of blood serum included the definition of interleukin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL-4), interleukin-6 (IL-6) and interferon gamma (if). Results. Morphological studies of periodontal tissues prove the development of chronic generalized periodontitis (pronounced inflammatory and resorptive processes). At the same time there are no expressed systemic reactions of blood and immunity. The revealed morphological changes in the periodontal tissue after complex influence on them indicate that we have developed an adequate model of experimental periodontitis. to create a way of modeling chronic periodontitis in laboratory rats has been developed.
chronic periodontitis model of periodontitis, laboratory animals, morphological study, laboratory tests
По данным американской ассоциации стоматологов, половина взрослых в возрасте 30 лет и старше имеют ту или иную форму заболевания пародонта [15]. Вместе с тем, многие авторы отмечают отсутствие надежных методов лечения данного заболевания и проблем, связанных с побочными эффектами лекарственной терапии [7]. Эти обстоятельства диктуют необходимость разработки новых лечебно-диагностических технологий в пародонтологии. Для этого необходимо создание адекватной модели хронического пародонтита на экспериментальных животных. В настоящее время существует ряд моделей данного заболевания, которые не обеспечивают развитие пародонтита у лабораторных животных с достоверными морфологическими проявлениями характерными для пародонтита [4-13]. Они имеют ряд существенных недостатков, ограничивающих возможности их использования В описаниях часто отсутствуют убедительные морфологические доказательства развития изменений ткани пародонта, характерных для хронического пародонтита. В связи с этим разработка новых моделей данного заболевания по-прежнему актуальна.
Цель работы: создание адекватной модели хронического пародонтита у лабораторных животных на основе современных представлений об этиологии и патогенезе данного заболевания.
Материалы и методы исследования: Для моделирования воспалительных заболеваний пародонта использовано 40 половозрелых самцов белых крыс породы Вистар массой 170 – 220 г в возрасте 4 месяцев. Животных содержали в стандартных условиях вивария ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России, предусмотренных «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных Приказом МЗ СССР №755 от 12.08.1977 г. и Приказом МЗ СССР №1179 от 10.10.1983 «Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения» с соблюдением общепринятых правила обращения с животными при температуре 18 – 20,5°С в условиях естественного светового цикла на стандартной диете, при свободном доступе к воде и пище. В эксперимент отбирали только здоровых животных, прошедших двухнедельную адаптацию к условиям вивария. Животные были разделены на 2 группы: контрольную и испытуемую. Болезненные манипуляции животным выполняли в условиях контролируемого наркоза. Для моделирования пародонтита у крыс использовано комплексное воздействие на ткани пародонта – механическое повреждение (разрыв циркулярной связки зуба), бактериальное обсеменение раневой поверхности, нарушение микроциркуляции тканей. Животному выполняли наркоз, в положении лежа на спине разрывали круговую связку зуба при помощи серповидной гладилки, далее вводили зубные отложения – зубной налет и камень от пациента, зубы шинировали. Для оценки воспалительных и репаративных процессов в тканях пародонта проводилось морфологическое исследование. Для исследования системных реакций организма использован комплекс лабораторных тестов. Общеклинический анализ крови выполнен на анализаторе МЕК. Подсчет лейкоцитарной формулы проводили унифицированным методом в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Проводилось исследование клеточного состава селезенки в мазках-отпечатках, окрашенных азур-эозином. Иммунологический анализ сыворотки крови включал определение концентрации интерлейкина-2 (ИЛ-2), интерлейкина-4 (ИЛ-4), интерлейкина-6 (ИЛ-6) и g-интерферона (gИФ) определяли методом твердофазного гетерогенного ИФА с использованием тест-систем «Вектор -Бест» и регистрацией на фотометре Multiscan. Лабораторные исследования крови и гистологическое исследование тканей пародонта нижней челюсти проводили до начала исследования, через 7 и 14 дней, 21 день, 35 день. Статистическая обработка результатов проводилась на основании принципов вариационной статистики с использованием программы Gretl. Описательная статистика включала среднее значение, стандартную ошибку, стандартное отклонение. Переменные с параметрическим распределением сравнивались при помощи критерия Стьюдента.
Результаты исследования, их обсуждение: Доказательством адекватности воспроизведенной модели хронического пародонтита являются результаты морфологического исследования. Морфологическое исследование на 7 сутки показало, что в связочном аппарате выражен отёк, определяются полнокровные сосуды со сладж-комплексами, диффузно-умеренная лимфоцитарная инфильтрация структур связочного аппарата и фокусы просветленного костного матрикса в костной альвеоле. В прилежащих мягких тканях пародонта определяются расширенные полнокровные сосуды и диффузная умеренно выраженная инфильтрация полиморфно-ядерными лейкоцитами с преобладанием эозинофилов. Гистохимическое исследование по Ван Гизону на коллагеновые структуры и костный матрикс на 14 сутки эксперимента показало признаки экссудативного воспаления в связочном аппарате зуба и фокусы резорбции костного матрикса. В окружающих мягких тканях определяются формирующиеся абсцессы с признаками инкапсуляции и очаговым ангиоматозом в перифокальной зоне. При гистологическом исследовании на 21 сутки эксперимента визуализируется связочный аппарат с признаками диффузной умеренной инфильтрации лимфоидными элементами. Определяются единичные полиморфно-ядерные лейкоциты в слизистой десны, в базальном слое и поверхностном слое в небольшом количестве определяются гранулоциты. Сосуды микроциркуляторного русла полнокровны, в части из них определяется краевое стояние лейкоцитов и признаки лейкодиапедеза. В области корня зуба под связочным аппаратом определяется фокус кровоизлияния, выраженное полнокровие сосудов, а между костными балками обнаруживается формирующийся абсцесс. Морфологическое исследование на 35 сутки эксперимента выявило множественные абсцессы. Как в мягких тканях пародонта, так и в кости обнаруживаются признаки организации, формирования соединительно-тканной капсулы и пролиферация клеток фибробластического ряда в перифокальной области. В структурах связочного аппарата обнаруживается умеренная диффузная инфильтрация лимфоидными элементами. В области корня зуба в мягких тканях определяются фокусы кровоизлияния и полнокровие сосудов микроциркуляции. Указанные морфологические изменения в тканях пародонта крыс аналогичны описанным при пародонтите у человека [3]. При создании данной модели оценивались не только локальные, но и системные реакции организма: картину крови, цитокиновый статус, спленоцитограмму. В частности, повреждение тканей пародонта не вызвало заметной лейкоцитарной реакции у крыс. Состояние других ростков кроветворения по данным показателей периферической крови (эритроциты, тромбоциты) существенно не менялось. Учитывая, что у крыс важным органом кроветворения является селезенка, мы оценивали ее клеточный состав. В цитограмме у контрольной группы содержание бластных форм составляло в среднем 1 %, лимфоидных клеток 87 %, гранулоцитов 7 %, прочих 5 %. Спленоцитограмма у животных с пародонтитом существенно не отличалась от таковой в контрольной группе. Поскольку в патогенезе пародонтита, как нами ранее показано, важную роль играют иммунные сдвиги [1,7], в крови крыс определяли некоторые цитокины, отражающие про- и противовоспалительную активность. При этом существенных различий в содержание ИЛ-2 и ИЛ-4 между группами не наблюдалось, а концентрация g-ИФ повышалась в 2,8 раза на 7 сутки (р=0,06) и 4,4 (р=0,05) на 14 сутки. Наибольшие изменения при пародонтите выявлены со стороны ИЛ6 – его уровень увеличивается в 1,7 раз на 7 сутки и в 2,3 раза на 14 сутки. Полученные данные представляются логичными, потому что ИЛ-6 является мультифункциональным цитокином, активно участвующим в реализации иммунного ответа и воспалительной реакции.
Вывод: Использование сочетанного воздействия на ткани пародонта лабораторных животных, включающее из механическое повреждение (разрыв циркулярной связки зуба), бактериальное обсеменение раневой поверхности, нарушения микроциркуляции тканей, приводит к развитию хронического генерализованного пародонтита. Его морфологическая картина аналогична с таковой у человека. Это доказывает, что нами получена адекватная модель пародонтита. Максимальные морфологические сдвиги выявлены у животных в период с 21 суток по 35 сутки после операции. Выраженной системной реакции крови при этом не обнаружено.
1. Bazarnyy V.V., Polushina L.G., Vanevskaya E.A. Immunologicheskiy analiz rotovoy zhidkosti kak potencial'nyy diagnosticheskiy instrument// Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal. -2014. - T. 8 (17), No 3. - S. 769-771.
2. Zhulev E.N., Kochubeynik A.V., Lapshin R.E. Eksperimental'noe modelirovanie vospalitel'nyh zabolevaniy parodonta // Zhurnal Fundamental'nye issledovaniya, vypusk №1-4. - 2015 g.
3. Zhunkeyro L.K., Karneyro Zh. Gistologicheskiy atlas: uchebnoe posobie // M. GEOTAR-Media. - 2009. - S. 329-33.
4. Kosenko K.N., Tkachenko E.K., Novosel'skaya N.G., Breus V.E. Model' narusheniy metabolizma soedinitel'notkannogo matriksa parodonta krys // Vestnik stomatologii. - Odessa 2012 g.
5. Leont'ev V.K., Faustov L.A., Galenko-Yaroshevskiy P.A., Popkov V.L., Sycheva N.L., Popkova L.V., Ordyan L.L. Hronicheskiy generalizovannyy parodontit: klinicheskaya i eksperimental'naya farmakoterapiya metabolicheskimi korrektora// Krasnodar: Prosveschenie-Yug, 2012. S. - 403.
6. Nikolaeva A.V. Modelirovanie eksperimental'nogo parodontita u krys v usloviyah toksicheskoy gipoestrogenii // Professional'nye izdaniya - Minsk 2015 g.
7. Polushina L.G. Svetlakova E.N., Mandra Yu.A., Bazarnyy V.V. Kliniko-immunologicheskaya harakteristika pacientov s hronicheskim parodontitom// Medicinskaya immunologiya. - 2017. - T. 19. - S. 133-134.
8. Sarkisyan N.G., Ron' G.I., Tuzankina I.A., Timchenko A.S., Larionov L.P., Bakurinskih A.A. Sposob polucheniya modeli hronicheskogo parodontita u krys // 2015 g.
9. Turovaya A. Yu., Kade A. H., Gubareva E. A., Uvarov A. V., Zanin S. A., Murzin I. G., Arakelyan Yu. L. Eksperimental'noe modelirovanie ostrogo periodontita u krys// Fundamental'nye issledovaniya. - 2010 g.
10. Bezerra M.M., de Lima V., Alencar V.B. Selective cyclooxygenase-2 inhibition prevents alveolar bone loss in experimental periodontitis in rats // J. Periodontol. - 2000. - Vol. 71. №6. - P. 1009-1014
11. Lallam-Laroye C. Periodontitis destructions are restored by synthetic glycosaminoglycan mimetic / C. Lallam-Laroye, Q. Escartin, A.S. Zlowodzki // Journal Biomedical Materials Research Part A - 2006. - Vol. 79. - №3. - P. 675-683.
12. Liu P.F., Haake S.K., Gallo R.L., Huang C.M. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis // Vaccine. - 2009. - Vol. 27. №10. - P. 1589-1595.
13. Nemcovsky C.E., Zahavi S., Moses O., et al. Effect of enamel matrix protein derivative on healing of surgical supra-infrabony periodontal defects in the rat molar: a histomorphometric study// J. Periodontol. - 2006. - Vol. 77. №6. - P. 996-1002
14. Polak D., Wilensky A., Shapira L., et al. Mouse model of experimental periodontitis induced by Porphyromonas gingivalis/ Fusobacterium nucleatum infection: bone loss and host response// J. Clinical Periodontology. - 2009. - Vol. 36. №5. - P. 406-410
15. Availableat: http://www. ada. org/en/publications/ada-news/2012-archive/august/prevalence-of-periodontitis
