Уфа, Республика Башкортостан, Россия
Уфа, Республика Башкортостан, Россия
Уфа, Республика Башкортостан, Россия
Уфа, Республика Башкортостан, Россия
ГРНТИ 76.29 Клиническая медицина
ОКСО 31.08.73 Стоматология терапевтическая
ББК 566 Стоматология
ТБК 5773 Стоматология
Предмет. Дрожжеподобные грибы рода Candida, являясь оппортунистическими условно-патогенными микроорганизмами, встречаются на слизистой полости рта более чем у половины всего населения. Однако о частоте обнаружения Candida в пародонтальных карманах существуют противоречивые данные. Доказано, что грибы рода Candida выделяются из содержимого десневой борозды и пародонтального кармана в 10―90,5 % случаев в разных географических регионах. При сочетании парадонтопатогенной микрофлоры и дрожжеподобных грибов рода Candida происходит суммарное воздействие, однако клиническая картина стирается и выявляется отягощенное основное заболевание. В связи с этим диагноз «кандида-ассоциированный пародонтит» ставится не часто, что сказывается на результатах лечения. Поскольку различные виды Candida имеют неодинаковую чувствительность к применяемым антимикотическим и антисептическим препаратам, для повышения эффективности лечения важно изучение видового состава микрофлоры и определение степени обсемененности пародонтальных карманов грибами рода Candida. Цель ― изучить видовой состав микрофлоры содержимого пародонтальных карманов при обострении ХГП и определить частоту встречаемости кандида-ассоциированного пародонтита. Методология. С помощью комплекса морфологических, биохимических и культуральных признаков у 189 больных хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения устанавливали вид дрожжеподобных грибов. Для подтверждения диагноза проводили культуральные исследования, микроскопическое исследование мазков отпечатков, а также геноидентификацию грибов в материале из пародонтальных карманов с применением полимеразной цепной реакции. Результаты. Установлено, что кандида-ассоциированный пародонтит встречается в 41,79 % случаях. Видовой состав в основном представлен Candida albicans и Candida Krusei. Выводы. Степень обсемененности пародонтальных карманов грибами зависит от степени тяжести пародонтита. При хроническом генерализованном пародонтите легкой степени установлена низкая и средняя степени обсемененности, средней ― средняя и высокая, тяжелой ― высокая.
хронический генерализованный пародонтит, кандида-ассоциированный пародонтит, видовая идентификация грибов, состав микрофлоры пародонтальных карманов, степень обсемененности пародонтальных карманов, грибы рода Candida
Введение
В полости рта находятся разнообразные микробиомы, включая бактерии, грибы, простейшие, вирусы. В ней определяют несколько биотомов: слизистая оболочка рта, зубная бляшка, десневая жидкость (ДЖ), зона десневой борозды и др.
В возникновении и развитии хронического генерализованного пародонтита (ХГП) играют роль сочетанные воздействия общих и местных факторов, находящихся в сложной взаимосвязи. Значение местных факторов в развитии пародонтита очевидно и не вызывает сомнения. Одним из них является зубная бляшка. Продолжительность существования микроорганизмов зубной бляшки зависит от их способности противостоять защитным силам организма человека. Примечательно, что микроорганизмы, у которых особенно хорошо развиты механизмы защиты, обитают в десневой бороздке и пародонтальных карманах. С увеличением глубины бороздки изменяется и показатель окислительно-восстановительного потенциала, и состав микрофлоры. На начальных стадиях формирования зубной бляшки преобладают грамположительные факультативные кокки, затем увеличивается количество грамположительных палочек, а в последующем возрастает количество грамотрицательных анаэробных форм [1―5].
Грибы рода Candida, являясь представителями нормальной микрофлоры, могут вести себя как сапрофиты. Однако при некоторых факторах экзогенного или эндогенного характера проявляют свои патогенные свойства и становятся участниками микробных ассоциаций при многих инфекционных заболеваниях, в том числе при воспалительных заболеваниях пародонта [6―10]. В последние годы в литературе используется термин «кандида-ассоциированный пародонтит», который отличается от кандидоза слизистой оболочки полости рта избирательной инвазией грибов не только в десневой эпителий, но и область пародонтальной связки [11―18]. При сочетании пародонтопатогенной микрофлоры и дрожжеподобных грибов рода Candida происходит суммарное действие. Однако клиническая картина кандидоза стирается и выявляется отягощенное основное заболевание. В связи с этим диагноз «кандида-ассоциированнный пародонтит» врачами практического здравоохранения ставится не часто, что сказывается на результатах лечения [19―24].
Цель исследования ― изучить видовой состав микрофлоры содержимого пародонтальных карманов при обострении ХГП и определить частоту встречаемости кандида-ассоциированного пародонтита.
Материал и методы исследования
Микробиологическое исследование для выявления пародонтопатогенной бактериальной флоры проводили с применением техники анаэробного культивирования (анаэростат Himedia). В качестве питательных сред использовали 5 % кровяной гемин-агар и среду Сабуро. Забор материала осуществляли из пародонтального кармана с помощью стандартных сорбирующих бумажных файлов (№ 30), которые помещали в 1 мл среды Стюарта для транспортировки в лабораторию. Посев на 5 % кровяной гемин-агар выполняли секторальным методом. Учет результатов роста колоний проводили на бинокулярной лупе МЛ-2Б. Идентификацию выделенных культур осуществляли по комплексу морфологических, биохимических и культуральных признаков с применением тест-систем API 200An (Франция). Всего выделено и идентифицировано свыше 180 штаммов представителей микробной флоры полости рта.
В содержимом пародонтальных карманов у 189 больных ХГП в стадии обострения (в возрасте от 30 до 44 лет, разного пола) также выявляли дрожжеподобные грибы с их последующей видовой идентификацией и определяли степень количественной обсемененности. При этом применяли микроскопическое и культуральное (микологическое) исследование.
Количество обсемененности грибами определяли по следующей методике. В соответствии с существующими рекомендациями тампон после забора материала помещали в 1 мл среды AC (Oxoid) и до момента доставки материала в лабораторию держали в холодильнике при температуре 4-6 °С. Доставку осуществляли в пределах 10-12 часов. Доставленный материал гомогенизировали в течение 2 минут и проводили количественный секторальный посев на среды, предназначенные для культивирования грибов. Количественный посев осуществляли на агар Сабуро с 1 % дрожжевым гидролизатом и добавкой ампиокса 2,5 г/л для подавления сопутствующей бактериальной флоры (селективная среда). Дальнейшее культуральное исследование проводили в соответствии с общепринятыми правилами медицинской микологии [25]. Полученные результаты обсемененности выражали через десятичный логарифм колониеобразующих единиц (lg КОЕ) в 1 мл.
После идентификации полученных изолированных колоний и подсчета их количества на среде Сабуро получали чистые культуры дрожжеподобных грибов. Культивирование проводили в анаэробных условиях 24 часа при температуре 37 °С, а затем еще 24 часа при комнатной температуре (до 5 суток).
С помощью комплекса морфологических, биохимических и культуральных признаков устанавливали вид выделенных дрожжеподобных грибов. Для дифференциации с сахаромицетами (истинными дрожжами) определяли наличие спор при окраске карболовым фуксином Циля. Для оценки типа филаментации использовали рисовый агар и проводили учет типа филаментации (Candida, Mycocandida, Mycotorula и др.). При этом также определяли наличие хламидоспор у вида С.albicans.
Всего выделено, идентифицировано и проанализировано 125 штаммов дрожжеподобных грибов.
Для подтверждения диагноза при положительном результате культурального исследования проводили микроскопическое исследование мазков-отпечатков, а также геноидентификацию грибов в материале из пародонтального кармана с применением полимеразной цепной реакции.
Материалом для исследования служили биоптаты десны, полученные при открытом кюретаже пародонтальных карманов.
Цитоморфологическое исследование проводили при помощи светового микроскопа в жидкой иммерсионной системе с 630-кратным увеличением. Фиксация проводилась по Майн-Грюнвальду, окраска ― по Романовскому―Гимзе.
Геноиндетификацию грибов проводили методом амплификации и детекции ДНК Candida albicans.
Результаты исследования и их обсуждение
В содержимом пародонтальных карманов при применении тест-систем API 200An (Франция) выделено и идентифицировано свыше 180 штаммов представителей микробной флоры, а видовой состав представлен в основном 9 видами. Они распределились следующим образом: род Streptococcus (5 видов), Staphilococcus (2 вида), дрожжеподобные грибы и коринебактерии (табл.1).
Среди стрептококков были выявлены различия в количестве штаммов. Больше всего составили стрептококки видов S. mitis (31 штамм ― 17,22 %) и S. mutans (30 штаммов ― 16,67 %), далее S. agalactis (26 штаммов ― 14,44 %) и S. salivarius (23 штамма ― 12,78 %), меньше всего были представители S. sanguis (17 штаммов ― 9,44 %).
К роду Staphilococcus относился 21 (11,67 %) штамм. Идентификацию их видов не проводили, ограничивались лишь определением способности свертывать цитратную плазму кролика (коагулазположительный). Этой способностью обладали 11 (6,11 %) штаммов (коагулазположительные), не обладали (коагулазотрицательные) 10 (5,56 %) штаммов.
Таблица 1
Идентификация выделенных культур в содержимом пародонтальных карманов
Table 1. Identification of isolated cultures in the contents of periodontal pockets
|
Вид |
Кол-во штаммов, абс. |
Удельный вес, % |
|
Стрептококки: |
|
|
|
- S. mitis |
31 |
17,22 |
|
- S. mutans |
30 |
16,67 |
|
- S. agalactis |
26 |
14,44 |
|
- S. salivarius |
23 |
12,78 |
|
- S. sanguis |
17 |
9,44 |
|
Стафилококки: |
|
|
|
- коагулазположительные |
11 |
6,11 |
|
- коагулазотрицательные |
10 |
5,56 |
|
Дрожжеподобные грибы |
21 |
11,67 |
|
Коринебактерии |
11 |
6,11 |
|
Всего |
180 |
100 |
К дрожжеподобным грибам относился 21 (11,67 %) штамм, коринебактериям (грамположительные палочки) ― 11 (6,11 %) штаммов.
Нами также изучена частота встречаемости данных видов микробных культур в содержимом пародонтальных карманов больных ХГП в стадии обострения. Она определялась в процентах путем деления числа случаев обнаружения конкретного вида на общее количество наблюдений и умножения на 100.
Результаты исследования показали, что у большинства больных в содержимом пародонтальных карманов встречаются S. mitis (у 116 ― 61,3 %), S. mutans (у 118 ― 62,43 %), S. agalactis (у 96 ― 50,709 %), S. salivarius (у 90 ― 47,63 %). Из стрептококков реже всего встречается S. sanguis (у 65 ― 34,39 %).
Также часто встречаются и дрожжеподобные грибы (у 79 ― 41,79 %).
Стафилококки и коринебактерии встречаются значительно реже (табл. 2).
Вышеуказанные микроорганизмы выделялись в основном в ассоциации, состоящие из двух, трех и даже четырех видов. В большинстве случаев (более 70 %) наблюдались ассоциации дрожжеподобных грибов с S. mitis или S. mutans, а также одновременно и с S. mitis и S. mutans. реже в ассоциации с другими стрептококками и коринебактериями.
Таблица 2
Частота встречаемости микроорганизмов в содержимом пародонтальных карманов
Table 2. Frequency of occurrence of microorganisms in the contents of periodontal pockets
|
Вид |
Кол-во штаммов, абс. |
Частота встречаемости, % |
|
Стрептококки: |
|
|
|
- S. mitis |
31 |
61,3 |
|
- S. mutans |
30 |
62,48 |
|
- S. agalactis |
26 |
50,79. |
|
- S. salivarius |
23 |
47,63 |
|
- S. sanquis |
17 |
34,39 |
|
Стафилококки: |
|
|
|
- коагулазположительные |
11 |
22,22 |
|
- коагулазотрицательные |
10 |
23,75 |
|
Дрожжеподобные грибы |
21 |
41,79 |
|
Коринебактерии |
11 |
23,8 |
|
Всего штаммов |
180 |
|
|
Всего количество больных |
189 |
|
Задачами следующего этапа исследования явились:
1) подтверждение результатов культурального исследования, свидетельствующего о наличии дрожжеподобных грибов морфологическими, а также молекулярно-генетическими исследованиями с помощью ПЦР;
2) видовая идентификация грибов;
3) определение степени количественной обсемененности пародонтальных карманов грибами (lg КОЕ в 1 мл).
Как было указано выше, из 189 больных ХГП при культуральном исследовании у 79 (41,79 %) были выделены дрожжеподобные грибы. Результаты культуральных исследований совпадали с результатами морфологических в 95,2 % случаях. При этом выявляли клетки дрожжеподобных грибов типичной морфологии (овальные, круглые), в некоторых случаях с почкой (всегда одной), псевдомицелий. В норме грибы рода Candida определяли в виде единичных дрожжеподобных клеток.
В начальных стадиях заболевания обнаруживали во многих полях зрения почкующиеся клетки грибов в небольших количествах (15-20), по мере развития заболевания количество элементов гриба возрастало, кроме обильно почкующихся бластоспор определяли псевдомицелий. При тяжелых хронических формах видны псевдомицелий и почкующиеся дрожжевые клетки более 30-40 во всех полях зрения, пенетрирующие сквозь десневой эпителий в пародонтальную связку.
По результатам анализа молекулярно-генетических исследований, проведенных с помощью ПЦР, совпадение отмечалось в 92,8 % случаев.
При идентификации выделенных чистых культур грибов установлено, что у 63 больных из 79 выделялся вид Candida albicans (у 79,75 % больных), причем у 15 пациентов в ассоциации с другими видами: с C.Krusei ― у 10, C.guilliermondii ― у 2 и C.glabrata ― у 3 (табл. 3).
С. Krusei выявлен у 21 больного (26,58 % больных), в том числе у 10 в ассоциации с C.albicans.
Виды C. stellatoidea и C. tropicalis выявлены всего лишь у трех и двух больных соответственно.
Таким образом, у больных хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения С.albicans по частоте выделения находился на первом месте, на втором ― С.Krusei.
Степень количественной обсемененности материала дрожжеподобными грибами нами изучена с учетом степени тяжести ХГП. При обострении ХГП легкой степени тяжести у 4 (13,79 %) больных отмечалась низкая степень обсемененности, у 25 (86,21 %) ― средняя. При ХГП средней степени тяжести у большинства больных (у 24 ― 88,89 %) наблюдалась умеренная степень, лишь
Таблица 3
Видовой состав штаммов дрожжеподобных грибов рода Candida,
выявленных у больных пародонтитом
Table 3. Species composition of strains of yeast-like fungi of the genus Candida,
revealed in patients with periodontitis
|
Вид грибов |
Количество больных |
|
|
абс. |
% |
|
|
Candida albicans |
48 |
60,76 |
|
Candida albicans в ассоциации с - С.Krusei - C.guilliermondii - C.glabrata |
10 2 3 |
12,66 2,53 3,80 |
|
Candida Krusei |
11 |
13,92 |
|
Candida stellatoidea |
3 |
3,8 |
|
Candida tropicalis |
2 |
2,53 |
|
Всего больных |
79 |
|
у 3 (11,11 %) ― высокая степень обсемененности. А при ХГП тяжелой степени у 20 (86,96 %) больных определялась высокая степень обсемененности, у 3 (13,04 %) ― средняя (табл. 4).
Выводы
Таким образом, согласно результатам проведенных исследований, кандида-ассоциированный пародонтит встречается в 41,79 % случаях. Видовой состав грибов представлен в основном Candida albicans и Candida Krusei. Степень обсемененности пародонтальных карманов грибами рода Candida зависит от степени тяжести пародонтита. При ХГП легкой степени тяжести отмечается низкая и средняя обсемененность, при ХГП средней степени тяжести ― средняя и высокая, а при ХГП тяжелой степени ― высокая.
Таблица 4
Обсемененность содержимого пародонтальных карманов грибом рода Candida в зависимости от степени тяжести заболевания
Table 4. Seeding of the contents of periodontal pockets with the fungus of the genus Candida depending on the severity of the disease
|
Степень тяжести |
Количество больных (абс., %) с разной степенью обсемененности (КОЕ/мл) |
М±m КОЕ/мл |
||
|
низкая (< 3 КОЕ/ мл) |
средняя (>3, <6 КОЕ/ мл) |
высокая (>6 КОЕ/ мл) |
||
|
ХГП легкой степени n =29 |
4 (13,79 %) |
25 (86,21 %) |
- |
3,8±0,01 |
|
ХГП средней степени n =27 |
- |
24 (88,89 %) |
3 (11,11 %) |
5,9±0,03 |
|
ХГП тяжелой степени n =23 |
- |
3 (13,04 %) |
20 (86,96 %) |
8,01±0,01 |
1. Воробьева, А. А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология : учебное пособие для студентов медвузов / А. А. Воробьева. - Москва : Мед. информ. агенство, 2004. - 136 с.
2. Горбачева, И. А. Патогенетическая коморбидность заболеваний внутренних органов и полости рта / И. А. Горбачева, Л. А. Шестакова // Пародонтология. - 2008. - № 3. - С. 3-5.
3. Цепов, Л. М. Проблема этиологии воспалительных генерализованных заболеваний пародонта / Л. М. Цепов, А. И. Николаев, М. М. Нестерова, Д. А. Наконечный // Современная стоматология - эффективность профилактики и лечения. Нанотехнологии в стоматологии : материалы конференции, посвященной 60-летию ТГМА. - Тверь, 2014. - С. 310-319.
4. Закаревич, Н. В. Серин-треониновые протеинкиназы бактерий - потенциальная мишень для регуляции состава микробиоты человека / Н. В. Закаревич, В. Н. Даниленко // Вестник РГМУ. - 2017. - № 2. - С. 20-29.
5. Анализ микробного состава биотопов полости рта у лиц молодого возраста в зависимости от стоматологического статуса / Л. П. Герасимова, И. Н. Усманова, Али Мохаммед Аль-Кофиш Мохаммед, М. М. Туйгунов, И. Р. Усманов // Уральский Медицинский журнал. - 2017. - № 7. - С. 31-35.
6. Бейбулатов, Г. Д. Клинико-морфологические особенности хронического пародонтита, ассоциированного с кандидозной инфекцией / Г. Д. Бйбулатов // Научные чтения : материалы науч.-практ. конф. молодых ученых СГМУ. - Саратов : СГМУ, 2011. - С. 6-7.
7. Бейбулатов, Г. Д. Клинико-морфологическое исследование тканей пародонта у пациентов с хроническим пародонтитом, ассоциированным с грибами рода Candida / Г. Д. Бейбулатов // Вестник Смоленской медицинской академии. - 2011. - С. 9.
8. Бейбулатов, Г. Д. Клинико-морфологическая характеристика и лечение хронического пародонтита, ассоциированного с кандидозной инфекцией / Г. Д. Бейбулатов, А. В. Лепилин // Стоматология - наука и практика. Перспективы развития : материалы Всерос. науч.-практ. конф., посвященной 50-летию основания стом. фак. ВолГМУ. - Волгоград, 2011. - С. 247.
9. Использование молекулярных маркеров в обследовании пациентов с патологией пародонта / Г. Д. Бейбулатов, Л. Ю. Островская, А. И. Ханина [и др.] // Вестник СГТУ. - 2013. - № 2. - С. 80-86.
10. Бейбулатов, Г. Д. Факторы, влияющие на развитие кандида-ассоциированного пародонтита / Г. Д. Бейбулатов, Л. Ю. Островская, А. В. Лепилин // Российский стоматологический журнал. - 2014. - № 4. - С. 36-38.
11. Токмакова, С. И. Лечение кандида-ассоциированного пародонтита с использованием современных ультразвуковых технологий / С. И. Токмакова, О. В. Бондаренко, Л. В. Чудова // Проблемы стоматологии. - 2013. - № 5. - С. 21-22.
12. Candida yeasts in chronic periodontitis tissues and subgingival microbial biofilms in vivo / A. Jarvensivu [et al.] // Oral. Dis. - 2004. - Vol. 10, № 2. - P. 106-112.
13. Probiotics and their fermented food products are beneficial for health / Z. S. Parve [et al.] // J. Appl. Microbiol. - 2006. - № 100 (6). - P. 1171-1185.
14. Особенности микробиоценоза десневой борозды и пародонтального кармана у пациентов с воспалительными и воспалительно-деструктивными заболеваниями пародонта, ассоциированными с грибами рода Candida / А. С. Комлева, О. А. Чепуркова, М. Г. Чеснокова, В. Б. Недосеко // Уральский медицинский журнал. - 2008. - № 10(50). - С. 74-78.
15. Микробиологический анализ состава грибковой и нормофлоры десневой борозды и пародонтального кармана у пациентов с воспалительными и воспалитльно-дестуктивными заболеваниями пародонта / В. Б. Недосеко, О. А. Чепуркова, М. Г. Чеснокова, А. С. Комлева // Маэстро стоматологии. - 2008. - № 32. - С. 65-71.
16. Распространенность грибковой флоры и особенности микробиоценоза у лиц с интактным пародонтом и с хроническими воспалительными заболеваниями пародонта / О. А. Чепуркова, М. Г. Чеснокова, В. Б. Недосеко, А. С. Комлева // Пародонтология. - 2009. - № 1(50). - С. 60-65.
17. Видовые и количественные характеристики состава нормо- и грибковой флоры биотопа десневой борозды и пародонтального кармана у пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта, проживающих на территории крупного промышленного города Сибири (г. Омск) / О. А. Чепуркова, А. С. Комлева, М. Г. Чеснокова, В. Б. Недосеко // Омский научный вестник. - 2009. - № 1(84). - С. 50-55.
18. Клинико-микробиологические особенности воспалительных и воспалительно-деструктивных заболеваний пародонта, ассоциированных с кандидозной инфекцией / А. С. Комлева, О. А. Чепуркова, М. Г. Чеснокова, В. Б. Недосеко // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2010. - № 2(30). - С. 70-73.
19. Slots, J. Antibiotics in periodontal therapy: advantages and disadvantages / J. Slots, T. E. Rams // J. Clin. Periodontol. - 1990. - Vol. 17. - P. 479-493.
20. Tanner, A. Microbial etiologi of periodontal diseases. Where are we? Where are we going? / A. Tanner // Curr. Opin. Dent. - 1992. - № 2. - P. 12-24.
21. Epidemiology, diagnosis and treatment of systemic candida infection in surgical patients under intensive care / J.-L. Vincent, E. Annasie, H. Bruining [et al.] // Intensive Care Med. - 1998. - Vol. 24. - P. 206-216.
22. Susceptibility of oral Candida species to calcium hydroxide in vitro / T. M. Waltimo, E. K. Siren, Orstavik [et al.] // Int. Endod J. - 1999. - Vol. 32, № 2. - P. 94-98.
23. In vitro susceptibility of Candida albicans isolates from apical and marginal periodontitis to common antifungal agents / T. M. Waltimo, D. Orstavik, J. H. Meurman, L. P. Samaragayake [et al.] // J. Oral. Microbiol. Immunol. - 2000. - Vol. 15, № 4. - P. 245-248.
24. Aggregatibacter actinomycetemcomitans as indicator aggressive be two analyzing strategies / B. Schacher, F. Baron, M. Roberg, M. Wohlfeil, R. Arndt, P. Eickholz // Journal of Clinical Periodontology. - 2007. - Vol. 34(7). - P. 566-573.
25. Сергеев, А. Ю. Руководство по лабораторной диагностике онихомикозов / А. Ю. Сергеев. - Москва : Гэотар - Медицина, 2000. - 160 с.
